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一种可分离通道的细胞培养微装置的研制

2018年2月21日

野田惠子，前田厚子，金谷康彦，Kae Sato先生*

化学和生物科学系，新利手机客户端科学院，新利手机客户端日本女子大学，邦乔，东京112-8681，日本

*电子邮箱：satouk@fc.jwu.ac.jp

为什么这个有用？

已有许多关于细胞培养用微流控装置的报道，其上下微通道由一层薄薄的PDMS膜分离。在这些设备中，下沟道常干扰上沟道细胞的显微观察。为了避免干扰，研制了一种具有可拆卸下通道的微型器件。

我需要什么？

材料以下内容：

PDMS（Silbot 184W/C，道康宁托雷）

己烷

PMMA板（56×76×2 mm）

玻璃载玻片（52×76 mm和26×76 mm）

盖板卡瓦（24×60 mm）

1千克重量

聚四氟乙烯管（1×2 mm和0.46×0.92 mm）

Tygon管（1.59×3.18 mm）

活检穿孔（1 mm和2 mm，KAI公司）

设备：

真空干燥器

烤箱（65摄氏度和100摄氏度）

旋涂机

等离子体发生器

真空泵

我该怎么办？

PDMS成型

以10:1的质量比混合弹性体和固化剂。在真空下对混合物进行除气，直到没有气泡为止（20分钟）。将脱气后的PDMS混合物倒在母版上，具有上通道（1×1×10 mm）或下通道（0.5×2×15 mm）结构，然后把它放在65摄氏度的烤箱里1小时。从母版上剥下PDMS复制品并将其粘到玻璃载玻片上（26×76 mm）。把它放在100摄氏度的烤箱中1小时（图1）。

PDMS薄膜的制备

在PMMA板上以500转/分的速度旋转600微升PDMS预聚物（质量比为10:1），持续20秒，然后以2400转/分的速度旋转600秒。在65摄氏度下烘烤1.5小时。

图1上部通道的PDMS板，下面的通道，PDMS膜，和管子。

PDMS膜和板与上通道的永久连接

用2-mm活检冲子在上通道两端的入口和出口孔上打孔。将PDMS膜和PDMS板的结合面与上部通道（上部板）暴露在100 W的等离子体中，35 s（图2a和2b）。层压并在65摄氏度下烘烤1小时（图2c）。取下PMMA表，从膜侧用1-mm活组织检查冲头打一个孔，将薄片与下通道连接。

图2（a）PDMS膜与上片粘接示意图。（b）血浆处理。（c）粘合PDMS膜和薄板。

PDMS膜和PDMS板与下通道的可拆卸连接

通过使用己烷稀释的PDMS预聚物（稀释比为1:3）作为胶水，将具有下通道（下板）的PDMS板粘合到PDMS膜上。^1个（图3a）。在玻璃载玻片（52×76 mm）表面以2000转/分的速度旋转稀释的PDMS预聚物（600μl）30秒，以用一薄层胶水覆盖载玻片，并将其培养10分钟以干燥溶剂（图3b）。将下片放在镀膜玻璃片上（图3c）。在与上薄板粘合的PDMS膜的四个角处涂上胶水（图3d）。从玻璃载玻片上剥下下下片材，将贴有胶水的片材表面放在PDMS膜上（图3e）。培养30分钟后，通过等离子粘合将下片粘合到盖片上。在设备上放置一个1-kg的砝码和一个玻璃片，并在100摄氏度下烘烤1小时（图3f）。

图3（a）PDMS膜与下片粘接示意图。（b）旋涂稀释的PDMS预聚物（胶）。（c）将下片置于稀释的PDMS预聚物的薄膜上。（d）将稀释的PDMS预聚物涂在PDMS膜的四个角上。（e）将下片的涂胶面放在PDMS膜上。（f）在设备上放置一个砝码和一个玻璃滑片，以在100°C下烘烤。

油管

将聚四氟乙烯（PTFE）管（1×2×100 mm）与Tygon管（1.59×3.18×10 mm）连接到上部微通道两端的孔上。将聚四氟乙烯管（46×0.92×150 mm）连接到下部通道的孔上。在管子根部涂上PDMS预聚物，然后在100摄氏度下烘烤1小时，以便牢固连接（图4a和b）。

细胞培养

将细胞悬浮液引入上部微通道，用0.1 mg/ml纤维连接蛋白手工预涂。在37摄氏度下用5%的一氧化碳培养设备。_二16小时，使细胞粘附在上通道底部（PDMS膜表面）。

下片脱落细胞观察

小心地从设备上取下下下薄板（图4c和d）。将装置的其余部分放在盖片上，用倒置显微镜观察（图4 F和H）。

图4（a）完整的微型装置。（b）微型装置的侧视图。细胞培养通道（上部）充满含有红色食物颜色的水，而下水道则充满了含有蓝色食物颜色的水。（c）和（d）小心地从微型装置上剥离下片。下片剥离前和剥离后细胞（E）的相位对比图像。细胞示踪红CMTPX（G）染色前后的荧光图像。

结论

我们开发了一种带有可拆卸下微通道的微流体装置。对于PDMS膜的每一侧，使用不同的粘合技术是很重要的。如果下通道充满空气，并且设备在一氧化碳中孵化_二培养箱，当设备从培养箱中取出时，经常在下通道中观察到露水凝结。下水道中的冷凝使观察变得困难（图4e和g）。这个问题用可拆卸装置解决了。

确认

这项工作得到了日本科学促进会（JSPS）Kakenhi Grant号JP16H04170的部分支持。新利手机客户端

参考

觉，B.H.，呵呵，D.，凯尔索斯，C.R.，豪森，T.，福泰，编号：高桥，S.（2007年）。多孔膜与层状微流控阵列系统的无泄漏键合.分析化学新利手机客户端79（九）3504–3508年。

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微流体装置中微生物的快速接种与回收

2017年10月4日

格雷纳，A.^1，2，请特夸，东海岸^1，3，请冈萨雷斯，A.^1个，请阮，D.⁴

^1个生物系，麦吉尔大学1205医生彭菲尔德，蒙特利尔，质量控制，H3A 1B1，加拿大。
^二生态与进化系，多伦多大学威尔科克斯街25号，多伦多，打开，M5S 3B2，加拿大
^三生态系，进化，以及自然资源，罗格斯大学大学农场路14号，新不伦瑞克，新泽西州08901，美国。
⁴米尔金斯克里斯蒂实验室，麦吉尔大学健康中心研究所，以及医学部，麦吉尔大学迪卡里大道1001号，蒙特利尔，质量控制，H4A 3J1号，加拿大。

为什么这个有用？

微流体装置被用于医学上许多不同类型的实验，生态和进化学科（Park等人，2003年；Keymer等人，2008年；康奈尔等，2013年；霍尔德克尔，2014年）。例如，用于微生物实验的微流体装置需要接种到模拟自然微生物环境（如多孔土壤）的较小的培养箱中（或等，2007）和生物宿主（Folkesson等人，2012年）。这些装置通常涉及复杂的泵装置和不可逆的密封。我们开发了一种只需要普通实验室设备的技术，使设备可重复使用，同时允许微生物不受干扰地生长（基于Tekwa等人，2015年；Tekwa等人，正在审阅中）。在这里，我们为聚二甲基硅氧烷（PDMS）回收微生物实验装置的组装和先前未记录的无损拆卸提供了详细的指导。原位，请然后，可以对其进行相对计数和进一步的种群变化的分子分析。每一步都有视频作为补充。

图1：含有14个栖息地的微流体装置，位于弹性体（PDMS）层上，压在60 mm x 24 mm玻璃盖卡瓦上。栖息地深度为10或20微米，直径从1400微米到2670微米不等，呈环状或网状斑块。该装置用于测试栖息地斑块对微生物动态的影响。栖息地被染成蓝色以便于观察。有关更多信息，请参见Tekwa等人。（2015年）。

我需要什么？

单层PDMS设备，一侧有栖息地
移液管+无菌移液管尖端
无菌培养皿（1/装置）
无菌镊子
接种物
过滤水
Kimwipes公司
可高压消毒塑料容器
乙醇
锡箔
无菌1μl接种环（1/生境）
无菌eppendorfs
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
生物安全柜（BSC）

我该怎么做？

清洁PDMS设备：应使用0.01N HCl对PDMS装置进行一次预处理，持续一小时，并对其进行等离子体处理，以保持其亲水性并易于与玻璃或塑料基板粘合（Cho等人，2007年；Tekwa等人，2015年）。将1/3的可高压消毒塑料容器装满70%乙醇和PDMS装置，然后用锡纸覆盖。让他们在水槽中静置30分钟以上，然后小心地将乙醇处理掉。向容器中加水10次，然后将其清空，以便冲洗设备。最后，用过滤水填充容器，用锡箔和高压灭菌器密封，以便对设备进行消毒。
接种设备（在生物安全柜中执行，BSC）：将设备在BSC中干燥30分钟。将特征朝上的设备放置在培养皿盖上，并放置少量（即0.7μl）接种到每个（样品装置中14个）上图1）栖息地。液体的量必须足以填满栖息地，但不能过多地防止PDMS和盖玻璃/培养皿之间的粘合（图2）。使用无菌镊子，拿起设备，面朝下放置在培养皿或盖玻片的中央，用戴着手套的手指反复按压背部，将其密封在表面上，使用Kimwipe从侧面吸走多余的液体。然后环绕，但不是触摸，将Kimwipes浸泡在过滤水中的装置（图3）确保设备不会在培养箱中变干，在关闭培养皿之前。在培养箱中直立放置所需时间。实验现在可以在24小时内保持原样（见补充视频）。

图2.带有细菌液滴的装置，每个栖息地1滴。

图3.一个“直立”的培养皿+Kimwipes+设备+盖玻片准备好孵化。

从设备恢复（在平衡计分卡中执行）：打开培养皿，小心地取下并丢弃Kimwipes，然后使用无菌镊子轻轻地打开设备并将其面朝上放置在培养皿盖中。大约12小时后，栖息地之间的空间将没有PDMS吸收的液体，防止微生物在拆卸过程中混入气室。已经干涸的栖息地将呈现白色（图4）不能使用。用PBS将无菌接种环浸入eppendorf中，然后用那个环刮一个栖息地（图5）再次将接种环浸入eppendorf培养基中，然后将其培养过夜进行进一步的分析，如电镀相对细胞计数（如果有不同菌株）和其他分子分析。对你感兴趣的其他栖息地重复上述步骤，使用新的接种环。现在可以像步骤1中那样清洁PDMS设备并再次使用。

图4.接种和孵化装置的视图，透过培养皿的底部看。

图5.从分解后的PDMS装置的栖息地中回收细菌。

我还应该知道什么？

回收技术可用于估计不同类型微生物的相对比例（例如变形频率）这在进行竞争分析和进化实验时很有用。与Tekwa等人不同。（2015年）这项技术放弃了共聚焦显微镜的使用；通过直接微生物回收和标准电镀程序来评估设备的含量。

链接到视频

这些视频经历了我们过去在铜绿假单胞菌可能有助于确定介质的具体数量，生长时间，等。这可用于类似PDMS微流控装置的实验。

第1部分-介绍+清洗设备网址：https://youtu.be/bne3zn3wu4q

第2部分-设备接种网址：https://youtu.be/p-uyireyym

第3部分-从设备中恢复网址：https://youtu.be/ylnmgxqmyge

补充-荧光细菌实验网址：https://youtu.be/lgmtrys62pa

确认

AGR得到了NSERC本科生研究奖和NSERC发现奖的支持。EWT得到了自然与科学基金会和生物多样性科学中心的支持。新利手机客户端加拿大研究主席计划和NSERC发现拨款支持了AGO。DN得到了CFI领导人机会基金（25636）的支持，Burroughs Wellcome Fund Cams奖（1006827.01）和CIHR薪酬奖。

工具书类

周，H.，詹森，H.，坎贝尔，K.，梅尔克，P.，威廉姆斯，J.W.，杰迪纳克，B.，…列夫钦科，A.（2007年）。高密度菌落的自我组织：有效的群体控制。公共图书馆生物学，请5个（十一）E302。

康奈尔，J.L.，里奇多夫，E.T.，怀特利，M.，&剪切力，J.B.（2013年）。显微细菌群落的三维打印。国家科学院学报新利手机客户端，请110（46岁）18380-18385年。

福克森，A.，杰尔斯巴克，L.，杨，L.，约翰森，H.K.，首席信息官，O.，伊比，编号：&莫林，S.（2012年）。铜绿假单胞菌对囊性纤维化气道的适应：一个进化的观点。自然评论。微生物学，请10个（十二）841年。

荷尔，F.J.，&德克尔，C.（2014年）。放大看看更大的画面：研究细菌的微流体和纳米制造工具。新利手机客户端，请346个（6208年）1251821年。

凯默，J.E.，加拉伊达，P.，兰伯特，G.，廖，D.，&奥斯汀，R.H.（2008年）。通过竞争细菌计算相互适应度。国家科学院学报新利手机客户端，请105（51）20269-20273年。

或者，D.，气味，B.F.，幽灵，J.M.，德切斯，A.，弗里德曼，S.P.（2007年）。不饱和多孔介质中影响细菌生境和活动的物理约束——综述。水资源进展，请30（6）1505-1527年。

公园，S.，沃拉宁，P.M.，尤兹巴什扬，E.A.，锡尔伯赞，P.，股票，J.B.，&奥斯汀，R.H.（2003年）。构成法定人数的动议。新利手机客户端，请301号（5630页）188-188年。

特夸，E.W.，阮，D.，容克，D.，洛劳，M.，&冈萨雷斯，A.（2015年）。微生境芯片中的斑片状结构影响细菌合作的进化动态。芯片实验室，请15个（18岁）3723-3729。

特夸，E.W.，阮，D.，洛劳，M.，冈萨雷斯，A.缺陷菌群与病原菌的合作有关。审查中。

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快速简便的玻璃培养皿制作，用于长期活细胞成像

2017年7月25日

山田洋子¹²³，请让·路易斯·维维¹²³，请凯瑟琳·维拉德¹²³和圣_潘尼除垢剂¹²³

^1个居里物理实验室，居里学院，PSL研究大学，CNRS UMR168，巴黎，法国。

^二索邦大学，UMPC大学巴黎06，巴黎，法国

^三皮埃尔·吉勒斯·德根尼斯研究所，巴黎，法国

邮箱：ayako.yamada@curie.fr

为什么这个有用？

玻璃是一种多用途的化学处理表面，它仍然是迄今为止最常用的表面工程基板（例如微关注，PDMS微流体装新利手机客户端置的表面化学）或等离子键合。在这种基质上进行细胞培养，玻璃底培养皿是为了保持细胞外明确的培养基体积，保护细胞免受污染和介质蒸发。而且，它们在光学上比通常用于细胞培养的聚苯乙烯培养皿更适合显微镜观察。尽管市场上有玻璃底培养皿（例如来自WPI的荧光皿）塑料墙的存在限制了可以在玻璃底面上进行的处理，而那些处理更昂贵（每盘5欧元；φ50 mm）比聚苯乙烯盘子（例如来自TPP的φ40 mm盘，每盘0.5欧元）。在这个提示中，我们描述了一种比以前的提示更简单的方法^1个把聚苯乙烯培养皿变成玻璃底培养皿，同时保留了在玻璃装配成盘子之前对其进行任何处理的可能性。注意，在这种方法中，培养皿的主体将被倒置，因此盖子不再被盖子塞子提升到盘子开口的上方。然而，通过身体和盖子之间的缝隙进行的气体交换似乎足以在这道菜中健康地培养细胞。总之，本发明提供了一种在微流体装置中或直接在培养皿中的工程表面上进行细胞培养的低成本快速解决方案。适合长期活细胞成像。

我需要什么？

φ40 mm聚苯乙烯组织培养皿（如TPP 93040）
φ40 mm盖板滑块（例如Thermo Fisher科学公司11757065，每张幻灯片～0.2欧元）
大螺丝刀（或类似工具）
PDMS基和固化剂的未固化混合物（10:1 w/w）
烤箱或热板
铁磁性金属板（例如PDMS容器盖，可选）
圆柱形磁铁（可选）

我该怎么办？

将一个聚苯乙烯培养皿倒放在表面上，用大螺丝刀夹住培养皿底部中心几次（图1a）直到盘底脱离盘壁（图1b）。成功率在9%到10%之间时，底部应该容易下降。不要用力敲打盘子底部，以免打碎盘子壁。
将未固化的PDMS混合物摊铺在平坦的基底上（例如一个较大的塑料培养皿），并在培养皿边缘（破碎部分）涂上PDMS（图1c）。
将盘子（破碎部分）放在盖玻片上（图1d）在烤箱或加热板上固化PDMS，例如80°C下10分钟（图1e）。
表面处理（例如微接触印刷）或PDMS芯片与玻璃表面的等离子粘合可以在碟片组装之后或之前进行（图1楼）。

为了保持片上细胞培养的湿度，这道菜可以用例如磷酸盐缓冲盐水（图2A）。装有芯片或微电池的盘子可以放在一氧化碳中。_二有或无进一步保护的孵化器（图2b）。
长期活细胞成像可以使用一个阶段顶部培养箱（图2c）。

我还应该知道什么？

根据显微镜的支撑类型，可能需要很好地对齐盘子和玻璃片的轮廓。这可以使用圆柱形磁铁（每盘3个）和铁磁金属板（图3a）在烤箱或加热板上进行PDMS固化时（图3b）。

确认

这项工作得到法国国家研究机构（ANR）的支持，作为“Avenir投资计划”（参考号：ANR 10-nano 0207）和ERC高级赠款大提琴（FP7-IDEAS-ERC-321107）的一部分。

参考

[1]卡巴列罗D，萨米蒂埃J，为活体细胞成像研究制造细胞培养室的不同策略。筹码和小费，2014年12月2日（//www.xcmww.com/chipsandtips/2014/12/02/different-strategies-for-the-fabring-of-cell-culture-chambers-for-live-cell-imaging-studies/）

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一个简单的，无泡细胞加载技术在芯片实验装置上培养哺乳动物细胞

2017年2月28日

萨赫萨德吉^1…*和Meltem Elitas^1个

^1个工程与自然科学学院新利手机客户端萨班奇大学34956，伊斯坦布尔，土耳其

^*萨赫萨德吉写了这篇论文.

目的

芯片实验室（loc）设备对不同学科的科学贡献显著。新利手机客户端聚二甲基硅氧烷（PDMS）是主要材料之一。广泛用于制造生物基因座，由于其生物相容性和易用性。然而，PDMS和其他一些聚合物材料本质上是防水材料（或疏水材料）。这导致装载和操作机车困难。在生物系统中，疏水性的显著后果是微流体通道中的气泡被截留。虽然PDMS的氧等离子体处理在一定时间内降低了表面疏水性，PDMS的亲水性随着时间的推移而消失。^1个.微流体中气泡的持续问题导致了为克服它而进行的几项研究。其中一些解决方案建议实施气泡捕集器。^二^，请^三，请通过亲水涂层对Locs的表面处理⁴，请使用主动控制的气泡去除系统^5个^，请⁶.

尽管上述设计复杂性被引入LOC，以减少气泡引起的堵塞问题，这些修改也会导致更高的生产成本，复杂的操作，设备准备时间长。在许多单细胞实验中，没有丢失或损坏稀有细胞，这些细胞需要被导入LOC。在这里，我们提出了一种简单的方法，可以在不在微流体通道中引入气泡的情况下加载少量细胞。

材料

·____PDMS	（Dow Corning Sylgard 184硅弹性体套件）
·____移液管头	（20-200毫升，埃彭多夫，#31200000917年）
·____Pipetman	（吉尔森，第200页，#69989-5页）
·____水乙醇70%	（扎格化学新利手机客户端）
·____细胞培养基	（数字多用表，泛生物科技，#P04-01548）
·____哺乳动物细胞	（MCF7，ATCC-HTB-22）
·____无菌注射器	（bd 10毫升注射器，鲁尔洛克尖端，#300912）
·____无菌汉密尔顿注射器	（汉密尔顿，100 ul糖浆，#84884页）

程序

步骤1：如图所示，在PDMS装置的入口和出口处插入两个200 ul的管头。图1.

第2步：使用移液管将70%含水乙醇引入进液管尖端。因此，微流体通道的内表面将进行消毒，并在微通道内测试流体流量，因为它在许多其他的LOC协议中应用。⁷^，请^8个.

第3步：轻轻地施加压力，按压移液管，使乙醇溶液流过PDMS装置的微通道和微腔。注意避免从出口管端施加负压，可能通过管道连接造成空气泄漏。此外，根据亨利定律，施加负压将直接影响气体在液体中的溶解量。⁹这可能有助于在微通道内形成更多的气泡。正压有助于通过溶解气泡去除气泡。

第4步：用乙醇溶液冲洗芯片后，检查芯片以确保去除气泡。如果有气泡，重复步骤2和3。

第5步：在注射器（10毫升）中注入中等或磷酸盐缓冲盐水（PBS）。注意清除注射器内的气泡，安装并锁定注射器上的针头。然后，将介质流过针，确保针中充满介质，没有任何气泡。将针插入进液管尖端；轻轻地施加正压，用介质代替乙醇。下一步，从出口管端收集多余的介质。

第6步：用新鲜介质填充入口管，由于入口和出口管尖中介质水平之间的一定高度（h）。微通道内将形成非常缓慢的介质流。

第7步：将您的电池装入汉密尔顿注射器，注意确保针头和注射器内没有气泡。如步骤5所述，将汉密尔顿注射器的针头插入进液管尖端，图1.通过向注射器施加温和的正压来引入细胞。PDMS芯片中建立的流将把释放的单元传送到芯片中所需的位置。流量可调节所施加的正压力和进出口管尖收集的介质量。可以收集出口管端多余的上清液，实验过程中可通过进口管端供给新鲜介质。

工具书类

棕褐色，S.H.，不适用阮，Y.C.公司蔡，和T.G.康，.生物流体学，2010年。4（三）。
郑，W.F.，Z.王先生，W.张，和X.Y.江，. 芯片实验室，请2010年。10个（21）：p.2906-2910年。
王先生，是的。D.李，L.S.公司张，H.杰恩，J.E.公司门多萨·埃利亚斯，T.A.公司哈瓦特，S.Z.公司哈桑，A.周，D.T.公司埃丁顿，和J。奥伯赫尔泽，. 生物医学微设备，请2012年。14（2）：P.419-426。
王先生，Y.L.，C.E.公司模拟人生，和N.L.奥尔布里顿，. 芯片实验室，请2012年。12个（17）：p.3036-3039。
卡尔森，J.M.，M.加辛，S.拉克索，T.哈拉德松，S.马尔霍特拉·库马尔，M.梅基，H.古森家，和W。范德威格纳特，. 芯片实验室，请2013年。13（22）：p.4366-4373。
科尔特斯，D.F.，T.-X.唐，D.G.S.公司卡佩鲁托，还有我。拉扎尔，. 传感器和执行器B：化学，请2017年。243个：p.650-657。
贝纳文特·巴贝斯，A.，D.加勒戈·佩雷斯，D.J.汉斯福德，S.阿兰娜，E.佩雷斯·洛伦佐，和M。穆吉卡，. 生物传感器与生物电子学，请2014年。61：p.298-305年。
是的，斯考伊，F.，R.上野，B.X.E.公司德比奥列斯，M.格里西，是的。酒井，B.J.先生基姆，和J。布鲁格，. 生物流体学，2016年。10个（一）。
亨利，W.，菲尔。变速器。R.社会责任委员会。伦敦.，1803年。93：29–274。

图1-微流体PDMS装置中电池加载程序示意图。

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一种新的低成本制备交联明胶膜的方法

2017年2月1日

加布里埃尔·皮蒂戈洛^1个还有瓦莱丽·塔利^1个

^1个插图UMRS1147，CNRS SNC 5014号巴黎笛卡尔大学2016年法国国家癌症控制设备。巴黎，法国。

电子邮件：邮箱：gabriele.pitingolo@parisdescartes.fr

为什么这个有用？

近年来，几种明胶类型（即格尔玛，a或b）因其良好的生物相容性而被用于药物制剂和组织工程，低成本下细胞分化和可用性的倾向。^1个明胶作为生物材料的使用也有利于调整基质的机械性能，改变水的浓度和交联度。然而，Transwell公司^畗是最常用的微孔膜渗透支架，是培养细胞的标准方法。^二这种商业化的支持物已被广泛应用于研究不同细胞类型的分子分泌，并复制了几种体外生理障碍（即血脑屏障）。^三Transwell公司^畗细胞培养插入很方便，因为它们是无菌的，易于使用，但是它们非常昂贵（每12包大约300美元），而且由于它们是由聚酯或聚碳酸酯制成，因此具有有限的生物材料特性。此外，正如法兰加和他的同事所展示的，这些多孔膜通常集成在微流控芯片上进行渗透性研究。⁴

最近，勇X。Chen等人提出了一种制备细胞培养用悬浮水凝胶膜平台的替代方法，设计了一个复杂的合成凝胶的协议，并用商用打印机制作了一个由聚乳酸（PLA）聚合物制成的开放式网格结构。^5个我们的提示显示了一种新的低成本的方法来制备交叉状明胶膜作为一个渗透性的支持，有助于潜在的生物应用。此外，提议的方案不需要使用复杂的制造技术或昂贵的材料。它使用来自猪皮肤的明胶和甲醛蒸气技术交联明胶膜。作为概念证明，我们将明胶膜集成到微流控芯片中，为静态和动态条件下的可比研究开发一个平台的可能性。

此外，为了证明制备的明胶膜对培养温度（约37°C）的抗性，我们在孵育前后（2天）测试了力学性能（杨氏模量）。最后，我们观察了机械性能和结构完整性的保存，使膜可用于细胞培养的研究。

我需要什么？

Transwell插件
猪明胶A型
甲醛溶液
手术刀
PMMA研磨室或类似

我该怎么办？

从Transwell中取出多孔膜^畗插入（图或者使用类似的自制支架。为了方便这一步是方便使用解剖刀沿整个直径切开膜。

膜移除后，Transwell®支持随时可用。将结构放置在PMMA室的中心（深度至少为2 mm）（图2a），并倒入10%w/v明胶，没有气泡，到PMMA室和Transwell内部^畗支撑（图2b）。稳定2分钟后，把系统放在冰箱里，至少10分钟。

凝胶时间（4°C下10分钟）后，可以从PMMA室中去除形成的明胶膜，借助手术刀促进分离（图3a-3b）。如图3c所示，明胶膜看起来非常平坦，细胞培养的理想特性（图3c）。为了保证细胞培养过程中机械性能的保持，使用经典方案“细胞生物相容性”交叉连接明胶膜，如甘油醛⁶，请甲醛⁷还有戊二醛^8个方法或天然产物，如京尼平。⁹

在这种情况下，采用气相甲醛法将制备的明胶膜交联，得到水溶性较低的体系。更高的机械强度和抗酶降解的稳定性。我们将明胶膜暴露在甲醛蒸气中1天。在图4a中，我们显示了差异，培养48小时后，在样本交叉链接（左）和非（右）之间。交联明胶膜的最终深度约为1 mm，然而，可以改变深度，调整液体明胶量。最后，我们计算过，潜伏期前后，交联明胶膜的杨氏模量，观察类似值40千帕（使用Instron DX液压测试系统进行压缩测试）。

将明胶膜集成到微芯片中。在本节中，我们详细介绍了明胶膜与微流控芯片的集成。例如，我们使用了我们先前工作中提出的相同几何图形。⁴，请制作渗透性实验装置（图5a）。如图5b所示，只需将液体明胶倒入较小的钻孔微通道，用移液管形成一层均匀的薄层明胶（图5C）。在4°C下胶凝后，用上述方法将形成的明胶膜交联，结果如图5d所示。为了连接不同的PMMA-PDMS基板，我们在这里提出了一种我们小组最近开发的磁性方法。^10个，请通过物理化学应力保护明胶膜，如溶剂蒸发和等离子粘合。图5e显示了最终的芯片。

结论：在这个提示中，采用一种简单、低成本的制备方法制备了一种新型生物相容性明胶渗透载体。可采用气相甲醛法或其他化学交联方法对整体明胶膜进行交联，作为细胞培养的潜在支架。此外，通过改变明胶的初始浓度，可以调节渗透膜的杨氏模量和厚度。交联度和液体明胶的量。最后，我们展示了明胶膜与模块化微芯片的集成。因此，我们提出了一种简单而低成本的方法来制备细胞生物学和其他应用的可渗透明胶膜。

确认

这项工作是在Pierre Gilles de Gennes研究所设备（“Investments d'Avenir”项目）的支持下开展的。参考文献：ANR 10-nano 0207）。

工具书类

格基，海克迈特，等。“作为细胞外基质模拟的工程水凝胶”，纳米医学5.3（2010）：469-484。
https://www.corning.com/worldwide/en/products/life-新利手机客户端sciences/products/pervative-supports/transwell-guidelines.html
瓜尼埃里，丹妮拉，等。“穿梭介导的纳米颗粒输送至血脑屏障”，小9.6（2013）：853-862。
法兰加，A.P.，皮提戈洛，G.，西兰塔诺，M.，科森蒂诺，A.，甜瓜，P.，维奇奥内，R.&内蒂，P.A.（2016年）。在流动条件下穿梭介导的纳米颗粒在体外大脑内皮的转运。生物技术和生物工程。
陈，勇X.，等。“用于细胞培养的新型悬浮水凝胶膜平台”，《工程与医学纳米技术杂志》6.2（2015）：021002。
西森，克里斯汀，等。“电纺明胶交联方法对细胞生长和活力的评价”，《生物大分子》10.7（2009）：1675-1680。
美国科技大学，M.，等。“整齐和填充明胶的行为和特性”，《生物材料》24.1（2003）：165-172。
塔莱宾，A.，等。《戊二醛对明胶薄膜性能的影响》，Kemija U Industriji 56.11（2007）：537-541。
比吉，A.，等。“通过与genipin交联来稳定明胶膜。”生物材料23.24（2002）：4827-4832。
皮提戈洛·加布里埃尔，等。“在流动条件下模拟内皮内衬微血管的模块化混合芯片的制造”，《微机械与微工程杂志》（接受稿）

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活体细胞成像研究中细胞培养室的不同制作策略

2014年12月2日

大卫·卡巴列罗^1，2，请萨米蒂埃^1，2

^1个纳米生物工程组，加泰罗尼亚生物工程研究所（IBEC）巴塞罗那，西班牙

^二Investigaci_n Centro de Investigaci_n Bioma_dica en Red de Bioingenier_a，生物材料Y纳米医药（Ciber-BBN）萨拉戈萨，西班牙。

为什么这个有用？

细胞的长期成像通常使用标准培养皿。经常，当样品操作和处理（例如功能化，免疫染色……）是必需的，实验前后^1个.为了解决这个问题，使用玻璃盖玻片。在细胞沉积之前，当遵循多步骤协议时，可以很容易地操纵它们。对于活细胞显微镜成像，定制的盖片固定在含有适当细胞培养基的支架（室）中。^二^，请^三 .这些支架要么由显微镜制造商提供，要么在机械车间制造；这意味着设计和金钱的时间。

在这篇文章中，我们展示了两种不同的策略，快速而廉价地制造活体细胞成像室，使用生物工程实验室通常提供的材料和简单工具。这些材料包括培养皿，聚二甲基硅氧烷（PDMS）Falcon管帽和玻璃盖卡瓦。在第一个策略（a）中，我们在一个培养皿中钻一个孔，在这个孔的底部用蜡固定一个定制的玻璃盖玻片。在第二个战略（b）中，PDMS框架用于将盖玻片固定在培养皿内。根据用户最终应用的不同，建议采用一种策略而不是另一种策略（见下文）。所有材料都具有生物相容性和易得性。这两种方法有几个优点：（一）简单、廉价；（ii）该等气室可在短时间内制造；（iii）这种方法避免了购买商用支架或向机械车间订购制造。

我需要什么？

图1

图1.制造自制房间所需的材料。

（1）产品数据管理系统
（2）玻璃盖玻片1，直径25 mm
（3）15毫升猎鹰（任何品牌）的盖子
（4）注射器5ml
（5）抛光纸
（6）蜡
（7）P35塑料培养皿（任何品牌）
（8）锋利镊子
（9）玻璃巴斯德移液管

您还需要：

热板
本生灯（可选）
烙铁（或电钻）
乙醇70%
烤箱
Sylgard 184 PDMS和交联剂（道康宁）

我该怎么办？

图1（上图）显示了使用策略A和策略B制造自制腔体所需的所有材料。接下来将详细介绍这两种策略的步骤。

策略A：

1.在p35皮氏培养皿的下部中间用预加热的方法制作一个直径约2厘米的圆孔，尖头烙铁。或者，可以使用钻头。使用一个15毫升的猎鹰帽作为模板，确保一个完美的圆孔（见图2A-C）。

图2.利用策略A制造细胞培养室。在岩石下部钻一个洞。（a）首先，在培养皿下部的中心画一个直径约2厘米的圆周。使用15毫升猎鹰帽作为模板。（b-c）下一步，烙铁用来钻孔。（d）最后，孔的边缘用薄抛光纸抛光。

2.第二步。用抛光纸抛光孔（见图2d）。检查皮特里没有碎片。用EtOH 70%冲洗样品。（可选：索尼特）。

三。使用镊子将玻璃盖玻片放置并固定在多孔盘背面的定制侧（例如功能化）面向Petri的内部（见图3a-b）。

图3.用蜡将玻璃盖玻片粘到钻孔培养皿的下部。（a）钻孔培养皿和玻璃盖玻片1，将直径为25 mm的（b）放在一起，并用镊子固定。（c）下一步，蜡是用热板熔化的。用玻璃巴斯德移液管将少量的毛细血管吸收。（d）沿着盖片和盘子所界定的边缘，密封室。此步骤对于确保良好密封至关重要。（e）检查确保没有留下任何打开的剩余点。（f）可使用本生灯或等效物熔化移液管内的凝固蜡。

第四章。用热板熔化蜡，并用小体积的巴斯德移液管（见图3c）。注意：毛细作用会使液体蜡在移液管内流动。

5.轻轻地，将吸液管（注满蜡）的尖端与盖玻片接触。沿着盖片和Petri形成的边缘（见图3d）。用蜡完全覆盖，直到整个轮廓被密封（见图3e）。如有必要，重新加注吸液管。注1：蜡可能在移液管内迅速凝固。如果是这样，使用本生灯（或等效物）再次熔化（见图3f）。注2：确保无空位；细胞培养基会流过它们。

6.培养感兴趣的细胞（见图4）。将试管放在显微镜内，开始活体细胞成像实验。注意：轻轻操作样品。

图4.完成了活体细胞成像实验室。（a）充满细胞培养基的室的正面图。（b）显示蜡密封区域的背面视图。未发现泄漏。实验结束后，用镊子轻轻地将盖玻片向下推，可以很容易地将盖玻片复原。

第七章。实验结束时，用镊子轻轻地向下推，可以去除介质并分离盖子。根据需要处理样品（例如免疫染色）。

策略B：

1.将15毫升猎鹰的盖子倒置插入p35培养皿的中间（见图5a）。

图5.利用策略B制造细胞培养室。（a）在p35培养皿的中心放置一个15毫升的猎鹰盖。使用注射器在空区域填充PDMS。（b）对样品进行脱气和固化。（c）拆下盖子并松开PDMS框架。

2.第二步。用注射器（或等效物）以10:1的比例（预聚物：交联剂）填充空白区域。脱气并在65℃下固化4h（见图5b）。注1：用胶带固定盖将确保其在固化过程中保持在中心位置。在这种情况下，固化必须在室温下进行一夜。注2：取下盖子后可能会出现非常薄的PDMS层。手动拆卸以确保PDMS中有通孔。或者，可以在盖的顶部施加重量。

三。用镊子取下盖子，松开PDMS框架（见图5C）。

第四章。对PDMS框架进行消毒。用70%乙醇冲洗，紫外照射15分钟。

5.在细胞培养室工作，在一个新的p35培养皿的中心放置一滴（~50 ul）培养基（见图6a）。

图6.完成了活体细胞成像实验室。（a）一小滴细胞培养基沉积在一个新的p35培养皿的中心。（b）定制的盖玻片放在上面。（c）将PDMS框架引入Petri内部，并向下推以固定形成试验室的盖玻片。最后，这个房间充满了细胞。

6.将（定制的）玻璃盖玻片面朝上放置在滴头顶部（参见图6b）。注意：这将确保不会形成气泡。用PDMS框架固定。

第七章。培养感兴趣的细胞（见图6c）。把样品放在显微镜里，开始实验。

8.实验结束时，通过用镊子拆卸PDMS框架，可以拆下介质并松开盖片。根据需要处理样品（例如免疫染色）。

图7.用于活体细胞成像研究的微加工盖玻片。（a）覆盖PDMS微观结构的玻璃盖玻片。（b）使用这两种策略，可以使用改良的盖片来制造腔体。（c）显微结构（平行凹槽）的放大图像。尺寸为：1 um x 1 um x 1 cm（高x宽x长）；凹槽之间的间隔为1 um。比例尺：10 um。（d）NIH3T3成纤维细胞平行于凹槽排列。箭头表示结构的方向。比例尺：50 um。

我还应该知道什么？

通过使用这两种方法，在实验室里可以很容易地制造出腔体。最重要的是，这种方法可以在细胞实验前后操纵盖片。如果盖片经过（生物）化学改性（例如与细胞外基质的蛋白质进行微排列）。必须小心快速地进行操作，以避免样品降解。同样地，对于细胞引导分析，盖玻片可以很容易地用微加工结构来调整细胞的生长和运动方向（见图7页）遵循本协议中描述的相同步骤。

对于战略A，用户必须了解蜡的熔化温度（约45摄氏度）。这意味着在37℃下进行实验时，密封可能很脆弱，必须轻轻操作以避免液体泄漏。其他材料和形状，除了圆形玻璃盖玻片，可以使用。这将取决于用户的实验需求。对于战略B，PDMS框架和盖玻片在某些应用中可以不使用Petri。然而，对于活细胞成像，需要在试验箱和显微镜台之间进行完美匹配，因此强烈建议使用petri。

最后，用户必须考虑实验所需的放大率和每个策略中样本的厚度。高倍显微镜（40x–100x）推荐使用策略A，低倍显微镜（4x–20x）推荐使用策略B。如果需要，可使用较薄的盖片（0）。

确认

博士。丹尼尔·里维琳，博士。Jordi Comelles（细胞物理实验室ISIS/IGBMC，斯特拉斯堡，法国）和David Izquierdo（纳米生物工程集团-IBEC，巴塞罗那，西班牙）得到技术帮助和讨论的认可。

工具书类

1.___Zanella F，洛伦斯·JB，链接W。高内容筛选：眼见为实。2010年趋势生物技术；28:237-45。

2.卡巴列罗D，沃图里兹R，D河。突起波动直接影响细胞运动。2014年生物物理杂志；107:34-42。

3.____Riveline D，布吉那A.观察电池组WO/2010/092116的装置和方法，2009年。

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一种在微流体装置中进行连续细胞培养的周期性无菌样品采集方法

2010年8月17日

德米特里A。马尔可夫，请^1，2 伊丽莎白M。莉莉E，E，^1，2 菲利普C。萨姆森，请^2，3 约翰P.威克斯沃，请^{1、2、3、4} 丽莎J。麦考利^2，5
^1个生物医学工程系，范德比尔特大学纳什维尔，总氮
^二范德比尔特综合生物系统研究与教育研究所（VIIBRE）范德比尔特大学纳什维尔，总氮
^三物理和天文学系，范德比尔特大学纳什维尔，总氮
⁴分子生理学和生物物理系，范德比尔特大学医学中心，纳什维尔，总氮
^5个癌症生物学系，范德比尔特大学医学中心，纳什维尔，总氮

为什么这个有用？

允许在长期缓慢灌注实验中进行无菌样本采集。微流体装置的最新发展及其在长期细胞和组织培养中的生物学应用带来了与定期无菌收集废水进行储存和进一步分析相关的额外挑战。泵（机械式或电渗式）和重力供料系统在以非常慢的流速（<1微升/分钟）输送介质时工作良好。然而，以这种速度采集样本成为一项非常重要的任务，尤其是当一个-二-，或者需要三个星期的实验。例如，以0.7微升/分钟的流量收集1毫升废水需要24小时。需要考虑的两个重要参数是采集步骤中的样品蒸发和多次定期采集期间的无菌维护。这些对于重力供料系统尤其重要，因为在重力供料系统中，细胞培养装置的输出端口必须打开以承受大气压力。为了克服这些挑战，我们已经测试了从电子显微镜科学（CAT）呼吸易透气粘合膜的使用。新利手机客户端#70536-10）作为样品收集小瓶顶部的无菌过滤器。这些膜很便宜，易于使用，以及透气性，允许流体畅通无阻地流入样品收集罐，同时在样品采集过程中保持整个系统的无菌性。在为期三周的细胞培养实验中，我们能够在5天的时间内从生物反应器中收集24小时的废水，同时保持整个系统的无菌性。使用上教堂阀门在废物贮存器（4天）和样品收集小瓶（1天）之间切换流量。通过将整个系统保持在100%湿度的二氧化碳细胞培养箱中，蒸发量得以减少。

我需要什么？

1.5毫升微量离心管
丁烷火炬或本生灯
用于刺穿的25号小加热针
插入微型离心管的23号不锈钢小管
90秒环氧树脂（Araldite 2043或类似产品）
小口径Tygon管（OD=1/16“，ID=0.020“）
钻头53
呼吸轻松膜（电子显微镜科学，新利手机客户端猫。#70536-10）

我该怎么做？

使用不锈钢接口连接器插入管：

用打火机加热穿刺针，本生灯，或用小丁烷火炬小心地在微型离心管的底部开一个孔。
使用4-6 mm长的小尺寸不锈钢接口管，并将其插入穿孔。该管的外径应比穿孔针（23 ga）大1或2个量规。油管直径大于25 ga。管子）。合身的应该是舒适的。
涂上一小粒90秒固化环氧树脂，将接口管固定到微型离心管上。
环氧树脂干燥后，将Tygon管送入不锈钢接口管。
在我们的例子中，我们用一根25 ga的针来制造一个孔和一根23 ga的不锈钢管（OD=0.022〃）作为1.5 ml微型离心管和柔性Tygon管（OD=1/16，ID=0.020英寸）。

直接插入软管的替代程序：

在微型离心管底部钻一个小孔
插入Tygon管并涂上90秒环氧树脂，将两部分粘合在一起。
我们使用了一个53号钻头（直径=0.0595英寸），用于1/16 OD的Tygon油管。

要应用过滤器：
应戴手套，在无菌条件下执行以下程序。生物安全柜或具有适当过滤的层流罩是足够的。易呼吸膜通常是由供应商无菌提供的，应在生物安全罩内打开，并在使用无菌镊子。可使用涉及高压灭菌器的常用程序对带有Tygon管的改进型微型离心管进行消毒。酒精，或γ辐射灭菌（未进行气体灭菌试验）。所有提到的方法都表现得相当好，而且相当充分；然而，我们发现，多个高压灭菌循环经常软化环氧连接，酒精灭菌需要对组件进行过度处理。伽马射线灭菌是最简单的，最简单的，以及最方便的方法。