薯条和小费

德米特里A。马尔可夫，^1,2 伊丽莎白M。莉莉E^1,2 菲利普C。参孙，^2,3 约翰P.维克斯沃，^{1、2、3、4} 丽莎J。麦考利^2，5
一生物医学工程系，范德比尔特大学Nashville,总氮
^二范德比尔特综合生物系统研究与教育研究所（VIIBRE）范德比尔特大学Nashville,总氮
^三Department of Physics and Astronomy,范德比尔特大学Nashville,总氮
^四分子生理学和生物物理系，范德比尔特大学医学中心，Nashville,总氮
^五Department of Cancer Biology,范德比尔特大学医学中心，Nashville,总氮

为什么这个有用？

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允许在长期缓慢灌注实验中进行无菌样本采集。微流体装置的最新发展及其在长期细胞和组织培养中的生物学应用带来了与定期无菌收集废水进行储存和进一步分析相关的额外挑战。泵（机械式或电渗式）和重力供料系统在以非常慢的流速（<1微升/分钟）输送介质时工作良好。然而，以这种速度采集样本成为一项非常重要的任务，尤其是当一个-两个，或者需要三个星期的实验。例如，以0.7微升/分钟的流量收集1毫升废水需要24小时。需要考虑的两个重要参数是采集步骤中的样品蒸发和多次定期采集期间的无菌维护。这些对于重力供料系统尤其重要，因为在重力供料系统中，细胞培养装置的输出端口必须打开以承受大气压力。为了克服这些挑战，我们已经测试了从电子显微镜科学（CAT）呼吸易透气粘合膜的使用。新利手机客户端#70536-10）作为样品收集小瓶顶部的无菌过滤器。These membranes are inexpensive,易于使用，以及透气性，允许流体畅通无阻地流入样品收集罐，同时在样品采集过程中保持整个系统的无菌性。在为期三周的细胞培养实验中，我们能够在5天的时间内从生物反应器中收集24小时的废水，同时保持整个系统的无菌性。使用上教堂阀门在废物贮存器（4天）和样品收集小瓶（1天）之间切换流量。通过将整个系统保持在100%湿度的二氧化碳细胞培养箱中，蒸发量得以减少。

我需要什么？

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• 1.5毫升微量离心管
• 丁烷火炬或本生灯
• 用于刺穿的25号小加热针
• 插入微型离心管的23号不锈钢小管
• 90秒环氧树脂（Araldite 2043或类似产品）
• 小口径Tygon管（OD=1/16“，ID=0.020“）
• 钻头53
• 呼吸轻松膜（电子显微镜科学，新利手机客户端猫。#70536-10）

我该怎么做？

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使用不锈钢接口连接器插入管：

• 用打火机加热穿刺针，本生灯，或用小丁烷火炬小心地在微型离心管的底部开一个孔。
• 使用4-6 mm长的小尺寸不锈钢接口管，and insert it into the punctured hole.  Outer diameter of this tubing should be larger by 1 or 2 gauges than the puncturing needle (23 ga.油管直径大于25 ga。管子）。合身的应该是舒适的。
• 涂上一小粒90秒固化环氧树脂，将接口管固定到微型离心管上。
• 环氧树脂干燥后，将Tygon管送入不锈钢接口管。
• 在我们的例子中，我们用一根25 ga的针来制造一个孔和一根23 ga的不锈钢管（OD=0.022〃）作为1.5 ml微型离心管和柔性Tygon管（OD=1/16，ID=0.020英寸）。

直接插入软管的替代程序：

• 在微型离心管底部钻一个小孔
• 插入Tygon管并涂上90秒环氧树脂，将两部分粘合在一起。
• 我们使用了一个53号钻头（直径=0.0595英寸），用于1/16 OD的Tygon油管。

要应用过滤器：
应戴手套并在无菌条件下执行以下程序。生物安全柜或具有适当过滤的层流罩是足够的。易呼吸膜通常是来自供应商的无菌膜，应在生物安全罩内打开，并用无菌镊子处理。改良的微型离心器带有Tygon管的GE管可使用高压灭菌器的常用程序进行消毒。酒精，或γ辐射灭菌（未进行气体灭菌试验）。所有提到的方法都表现得相当好，而且相当充分；然而，我们发现，多个高压灭菌循环经常软化环氧连接，酒精灭菌需要对组件进行过度处理。伽马射线灭菌是最简单的，最简单的，以及最方便的方法。

• 从无菌膜和带适当管子的微型离心管开始。
• 切掉微型离心管的快盖。
• 从Breathe Easy过滤器的一侧剥下一半保护膜，并将暴露在外的过滤器粘合侧连接到管的顶部边缘。
• 然后，取下保护膜的后半部分，并完全连接过滤器（确保周围的密封良好，用钳子的平边缘施加牢固的压力）。
• 准备好使用组件时，小心地去除顶部保护层。

在长期细胞培养过程中，我们使用这种方法定期对生物反应器滤筒中的废水进行取样。每个滤筒包含4个反应器，它们连接到图4d所示的单个管汇上。

图1.所需工具和用品

图2.Preparing the microcentrifuge tube – Method 1.a）用热针穿孔。b）一根不锈钢针插入穿孔中。c）插入管用90秒环氧树脂固定到位。d）连接到接口管上的柔性Tygon管。

Figure 3.准备微型离心管-方法2。a）在底部钻孔。b）钻孔视图。C) Insertion of the small diameter Tygon tubing.D) Application of the 90 second epoxy to fix the inserted tube in place.

图4.Preparation of the sterile cover.a）从过滤器的粘合侧去除保护塑料。B) Filter membrane is attached to the tube rim.c）小心地从连接到管道的薄膜上取下顶部保护塑料。d）将过滤器安装在样品架上并连接到收集网络的管道视图。

确认

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我们感谢以下赠款提供的支持：NIH/NCI R21 CA126728-01A1和DOD/BCRP W81XWH-09-1-0444。